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设计文档简介
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摘要
Abstract
前言
第一部分 红色毛癣菌不同时相cDNA文库的构建，克隆测序与分析
前言
材料与方法
实验材料
实验方法
结果
讨论
第二部分 红色毛癣菌cDNA基因芯片的制备与验证
前言
材料与方法
实验材料
实验方法
结果与讨论
第三部分 不同浅部致病真菌之间比较基因组分析
前言
材料与方法
实验材料
实验器材、实验仪器
分析软件
实验方法
结果与讨论
小结
参考文献
致谢
综述 分子生物学技术在医学真菌鉴定和分型上的应用
参考文献
摘 要：
与细菌和病毒相比，真菌的研究整体来说还比较落后。现在，随着真菌病发病率的增高，以及对真菌研究的不断深入，人们已经逐渐认识到真菌在进化，比较基因组学研究，致病，以及工农业上的重要作用，对真菌的研究也开始逐渐重视。在真菌病中，浅部真菌病的发生率最高，在世界各地广泛流行，近年来，浅部真菌病的发病率明显呈上升趋势。其中60%以上的浅部真菌病为红色毛癣菌感染所致。
目前对红色毛癣菌的研究还大多停留在对癣病进行临床观察治疗，对不同致病株进行分型鉴定的基础上。诊断主要依据形态学和生理学观察，不够准确且费时。红色毛癣菌引起的癣病极为顽固，常出现复发和再感染，现有药物难以达到根治效果，而且随着药物长期使用，一些常用药物特别是唑类药物的耐药性日益严重。世界上针对皮肤癣菌的药物市场十分巨大，据不完全统计，1998年国际市场抗真菌药物销售总额达40~42亿美元。
本文在世界上首次构建了红色毛癣菌BMU01672生长过程中6个不同时相的cDNA文库，完成了近50,000条cDNA测序，通过聚类分析，获得9,683条ESTs，其中 Contigs 3,199 个, Singlets 6,464个。利用COG软件，对这些ESTs进行功能分类，明确了它们在信息存储与加工、细胞生理过程和各类代谢中的作用，阐明了一些真菌独特的结构，生理特点和代谢途径。
对9683条EST进行了筛选，在尽可能得到尽量多的信息的前提下，筛选出了8728条EST序列进行后续的芯片制备研究，其中Contigs 2,718 个,Singlets 6,010个，制备了红色毛癣菌EST芯片。对该芯片进行了RNA和DNA杂交，通过对RNA的不同标记方法摸索出了适合红色毛癣菌的RNA量及标记，杂交方法；对BMU01672基因组DNA的杂交结果表明92%的点在芯片上有信号，表明该芯片可以用于基因组DNA的杂交。
本文还应用红色毛癣菌EST芯片完成了22株皮肤癣菌的比较基因组学研究。发现，除疣状毛癣菌，地球毛癣菌和石膏小孢子菌外，其它菌株共有4126条基因，可能参与45条代谢途径，这些菌株之间在能量代谢，脂代谢和氨基酸代谢方面的保守性比较高，但疣状毛癣菌，地球毛癣菌和石膏小孢子菌中与其它菌株差异较大。
对这些菌株基因组的杂交结果中共有基因的数目分析，水平聚类分析以及系统发生分析的结果显示，与现有分类结果有所不同的是，毛癣菌属内的成员（除阿耶罗毛癣菌，地球毛癣菌和疣状毛癣菌）和杂色小孢子菌，表皮毛癣菌亲缘关系较近，小孢子菌属成员（除杂色小孢子菌，石膏小孢子菌）和阿耶罗毛癣菌亲缘关系较近。地球毛癣菌，疣状毛癣菌和石膏小孢子菌单独聚成一个特殊的类，与上述两个类亲缘关系较远。
根据芯片分析结果，还得到了一些不同菌株中杂交现象不同的基因，这些基因的杂交情况将进一步用大量的临床菌株进行验证和进一步的筛选，以得到一些分子水平上的诊断标记。
Abstract: Compared to bacteria and virus, the research of fungi remained undeveloped. Now, with the increase of the incidence of disease caused by fungi, the important role of fungi in the research on evolution, comparative genomics, pathogenicity, and the influence on industry and agriculture have been gradually understood. Among the numerous pathogenic fungi, dermatophytes are the most common fungus . They are the etiologic pathogens of various dermatophytoses, affecting up to 25% of infections to the world’s population,. The percentage of infection has continued to increase in recent years , with at least 60% of all infections of this type caused by Thichophyton rubrum.
结论：
1. 作为主要完成人首次构建了红色毛癣菌生长过程中6个不同时相的cDNA文库，完成了近50,000条cDNA测序，通过聚类分析，获得9,683条ESTs，其中 Contigs 3,199 个, Singlets 6,464个。利用COG软件，对这些ESTs进行功能分类，明确了它们在信息存储与加工、细胞生理过程和各类代谢中的作用。阐明了一些真菌独特的结构与代谢途径，首次从分子水平推测红色毛癣菌内的主要信号传导系统可能是二组分信号传导系统，在EST文库中发现了一些与红色毛癣菌致病性有关的胞外蛋白酶序列，首次应用生物信息学方法推测EST库中相关基因可能参与近80条代谢途径，根据对代谢酶类和细胞膜上的转运体数量和种类初步阐明了一些红色毛癣菌的生长条件和代谢方式，同时，细胞膜上的两类药物外排泵的发现表明该株红色毛癣菌中具有药物外排这一耐药机制。
2. 作为主要完成人对9683条EST进行了筛选，在尽可能得到尽量多的信息的前提下，筛选出了8728条EST序列进行后续的芯片制备研究，其中Contigs 2,718 个,Singlets 6,010个。对Contigs中模板质粒的选取标准是该克隆的插入片段尽量靠近该基因的3’端。对这些质粒模板进行PCR，对产量不足的基因进行二次扩增或Nested PCR,共有8577个基因达到要求，PCR成功率达到98%，其它的点在芯片的dataset上设置为empty。对该芯片进行了RNA和DNA杂交，通过对RNA的不同标记方法摸索出了适合红色毛癣菌的RNA量及标记，杂交方法；对基因组DNA的杂交结果表明有92%的点在芯片上有信号，表明该芯片可以用于基因组DNA的杂交。
3. 应用红色毛癣菌EST芯片完成了常见皮肤癣菌的比较基因组学研究。首次展示了22种皮肤癣菌可能具有的基因，现了对共有基因的种类分析发现，除疣状毛癣菌，地球毛癣菌和石膏小孢子菌外，其它菌株共有4126条基因，可能参与45条代谢途径，推测这是这些皮肤癣菌生存所必须的基本代谢。分析还表明这些菌株之间在能量代谢，脂代谢和氨基酸代谢方面的保守性比较高，目前临床上常用的唑类药物的作用途径固醇代谢在绝大多数菌株中都很保守，但是在疣状毛癣菌，地球毛癣菌和石膏小孢子菌中差异较大。对共有途径的分析从分子水平上阐明了皮肤癣菌糖酵解的特点。
对这些菌株基因组的杂交结果中共有基因的数目分析，水平聚类分析以及系统发生分析的结果显示，在这些菌株中，与红色毛癣菌的亲缘关系由近及远的顺序为：西非毛癣菌，杂色小孢子菌，玫瑰毛癣菌，断发毛癣菌，T.erinacei，絮状表皮癣菌，纵向毛癣菌，许兰毛癣菌，紫色毛癣菌，须癣毛癣菌；猪小孢子菌，柯克小孢子菌，M.rivalieri，歪斜小孢子菌，总状小孢子菌，犬小孢子菌，阿耶罗毛癣菌，M.gallinae；地球毛癣菌，疣状毛癣菌，石膏小孢子菌。总体来说，毛癣菌属内成员与红色毛癣菌的亲缘关系比小孢子菌属要近。分析结果还显示，毛癣菌属内的成员（除阿耶罗毛癣菌，地球毛癣菌和疣状毛癣菌）和杂色小孢子菌，表皮毛癣菌聚成了一类，小孢子菌属成员（除杂色小孢子菌，石膏小孢子菌）和阿耶罗毛癣菌聚成了一类。地球毛癣菌，疣状毛癣菌和石膏小孢子菌单独聚成一个特殊的类，与上述两个类亲缘关系较远。
根据芯片分析结果，还得到了一些不同菌株中杂交现象不同的基因，这些基因的杂交情况将进一步用大量的临床菌株进行验证和进一步的筛选，以得到一些分子诊断标记。
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