摘　　　　要

吡虫啉是一种低毒、广谱、高效、有效期长、安全性好和不易产生耐药性等特点，能高效杀灭刺吸式昆虫的新型烟碱类杀虫剂。虽然是低毒，但长期积累，仍会有一定的危害，而且对某些昆虫是高毒物质，因此对吡虫啉的有效检测仍是必要的。免疫分析法具有快速，特异性强等优点，本论文拟进行吡虫啉半抗原、人工抗原的合成及抗血清的制备研究，主要研究内容及结果如下：

（1）    吡虫啉半抗原及人工抗原的合成及鉴定

合成了3种半抗原IMMP、IMMB及IMEB，其中IMMP以巯基丙酸为原料，在KOH条件下100℃油浴3h；IMMB以巯基丁酸为原料，在KOH条件下80℃油浴4h；IMEB以4－溴丁酸乙酯为原料，反应条件为0℃冰浴反应1h，室温下再反应12h后，60 酸性条件下反应4h。各产物经薄层层析法、紫外扫描法及质谱法的鉴定，均获得目标物；用混合酸酐法和活泼酯法进行半抗原的偶联，经紫外扫描法鉴定，获人工抗原IMMP-OVA 、IMMB-OVA、IMEB-OVA及IMMP-BSA。

（2）    吡虫啉抗血清的制备及鉴定

以IMMP-BSA为免疫抗原，对雌性Balb/c小鼠进行免疫，第6次免疫后的第5天从小鼠尾部取血，得抗血清。以3种不同包被抗原IMMP-OVA 、IMMB-OVA及IMEB-OVA作对比，进ELISA检测，得知IMMP-OVA包被抗原效果最好，且最佳包被抗原是结合比为14:1；最佳包被浓度为4μg/mL，最佳竞争反应时间为1h；以丙酮为溶剂，反应缓冲液的pH为7.5，NaCl浓度为0.15mol/L； Ic50为0.9954μg/mL，检测限(Ic20)为0.031μg/mL其对IMMB的交叉反应率分别为21%。，对IMEB则无交叉反应，该抗体有较好的特异性。

关键词：吡虫啉　　人工抗原　　合成 　 抗血清 　 ELISA

 

目　　    录

缩略语表

1　前言······· 1

2　材料与方法················· 2

2.1　材料与仪器····· 2

2.1.1　主要化学试剂·········· 2

2.1.2　主要仪器和设备······ 3

2.2　实验方法········· 4

2.2.1　吡虫啉半抗原的合成与鉴定·· 4

2.2.1.1　吡虫啉半抗原的合成·········· 4

2.2.1.2　半抗原IMMP、IMMB、IMEB的鉴定·········· 6

2.2.2　吡虫啉人工抗原的合成与鉴定·············· 6

2.2.2.1　吡虫啉人工抗原的合成······ 6

2.2.2.2　吡虫啉人工抗原的鉴定······ 7

2.2.2.3　人工抗原浓度的测定·········· 7

2.2.2.4　人工抗原结合比的测定······ 8

2.2.3　吡虫啉多抗血清的制备·········· 8

2.2.3.1　吡虫啉免疫抗原IMMP－BSA的动物免疫·· 8

2.2.3.2　吡虫啉多抗血清的制备······ 9

2.2.4　吡虫啉ELISA方法的建立· 9

2.2.4.1　酶联免疫吸附分析（ELISA）的基本操作·········· 9

2.2.4.2　包被抗原的检测鉴定·········· 9

2.2.4.3　最佳包被抗原浓度的确定 10

2.2.4.4　最佳竞争时间的确定········ 10

2.2.4.5　不同有机溶剂对ELISA的影响········· 11

2.2.4.6　不同反应缓冲离子强度对ELISA的影响········· 11

2.2.4.7　不同反应缓冲液pH值对ELISA的的影响····· 11

2.2.4.8　交叉反应····· 11

3　实验结果与分析······· 11

3.1　吡虫啉人工半抗原及包被抗原的鉴定 11

3.1.1　吡虫啉人工半抗原的合成···· 11

3.1.1.1　薄层层析法鉴定结果········· 11

3.1.1.2　吡虫啉人工半抗原合成···· 13

3.1.2　吡虫啉人工半抗原的鉴定···· 15

3.1.2.1　紫外扫描法 15

3.1.2.2　谱法 15

3.1.3　吡虫啉人工抗原的鉴定········ 22

3.2　血清抗体分析 23

3.2.1　包被抗原的检测鉴定············ 24

3.2.2　最佳包被浓度的确定············ 24

3.2.3　血清效价 25

3.2.4　最佳竞争反应时间的确定···· 26

3.2.5　不同有机溶剂对ELISA的影响···· 26

3.2.6　不同反应缓冲液离子强度对ELISA的影响···· 27

3.2.7　不同反应缓冲液pH值对ELISA的影响···· 28

3.2.8　交叉反应 28

4　实验讨论··················· 29

4.1　吡虫啉半抗原的合成······· 29

4.2　ELISA影响因素 31

5　实验结论··················· 31

致谢··········· 33

参考文献··· 34

英文摘要··· 35

毕业论文成绩评定表······· 36

 

 

 

 

缩 略 语 表

 

缩略词     英文                                                          中文

BSA                     Bovine serum albumin                     牛血清白蛋白

DMF                     N,N-Dimethylformamide                      N,N-二甲基酰胺

DMSO                     Dimehtyl Sulfoxide                     二甲基亚砜

DCC                     N,N-Dicyclohedxylcarbodiimid                      N,N-二环己基碳二亚胺

ELISA                     Enzyme Linked Immunosorbent Assay                     酶联免疫吸附测定

IM         N-(1-((6-chloropyridin-3-yl)methyl)imidazolidin-2-ylidene)nitramidene

吡虫啉

IMMP     3-(5-((2-(nitroimino)imidazolidin-1-yl)methyl)pyridine-2-ylthio)propanoicacid

                                         3-(5-(2-硝基亚胺-1-咪啉甲基)-2-吡啶)-S-丙酸

IMMB     4-(5-((2-(nitroimino)imidazolidin-1-yl)methyl)pyridine-2-ylthio)butanoicacid

4-(5-(2-硝基亚胺-1-咪啉甲基)-2-吡啶)-S-丁酸

IMEB     4-(3-((6-chliripyridin-3-yl)methyl)-2-(nitroimino)imidazolidin-1-yl)butanoic acid

4-(3-(6-氯-3-吡啶甲基)-2-(硝基-1-咪啉基)) -丁酸

NHS                     N-hydroxysuccinimide                     N-羟基琥珀酰亚胺

OD                     Optical Density                     吸光度

OVA                     Ovalbumin                     卵清白蛋白

PBS                     Phosphate Buffer Solution                     磷酸盐缓冲溶液